от автора: Джастин Джексон, Phys.org
Исследователи Mammoth Biosciences разработали NanoCas, сверхкомпактную нуклеазу CRISPR, демонстрирующую ее способность выполнять редактирование генов в тканях, отличных от печени, включая скелетные мышцы, с использованием одного вектора аденоассоциированного вируса (AAV). Эксперименты на нечеловекообразных приматах (NHP) привели к эффективности редактирования, превышающей 30% в мышечных тканях.
Редактирование генов CRISPR произвело революцию в генетике, но проблемы доставки ограничили его клиническое применение в первую очередь ex vivo и терапией, направленной на печень. Обычные нуклеазы CRISPR, включая Cas9 и Cas12a, превышают пределы упаковки одного вектора AAV, что требует стратегий с двумя AAV, которые снижают эффективность.
Были идентифицированы более мелкие системы CRISPR, такие как Cas12i и CasX, но они остаются слишком большими или демонстрируют низкую эффективность редактирования. Существующие компактные системы, такие как Cas14 и IscB, не продемонстрировали надежной эффективности в моделях крупных животных.
В исследовании «Редактирование скелетных мышц приматов с помощью одного AAV CRISPR с помощью NanoCas, ультракомпактной нуклеазы», опубликованном на сервере препринтов bioRxiv , исследователи провели комплексный метагеномный скрининг, в ходе которого было проанализировано 21 980 метагеномов для выявления ультракомпактных систем CRISPR.
Исследователи отобрали 176 кандидатов на нуклеазы из 600 аминокислот, оценив их с помощью компьютерного прогнозирования структуры РНК, идентификации последовательности PAM и анализов редактирования хромосом клеток млекопитающих.
Наиболее эффективный кандидат, названный NanoCas, был дополнительно оптимизирован с помощью белковой инженерии. Вариант с заменой аргинина в позиции 220 (D220R) улучшил связывание ДНК и эффективность редактирования. Эффективность редактирования оценивалась на эмбриональных клетках почек человека (HEK293T), Т-клетках и CD34 + гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках.
Для тестирования in vivo NanoCas доставлялся через AAV8 мышам для таргетинга Pcsk9, гена, регулирующего холестерин, достигая ~60% эффективности редактирования в печени и снижения уровня PCSK9 в сыворотке. Дополнительные исследования были нацелены на сайты сплайсинга экзонов в дистрофине для изучения потенциальных приложений для мышечной дистрофии Дюшенна.
В экспериментах на нечеловеческих приматах для доставки в мышцы использовали AAV9-4A. Яванским макакам делали системные инъекции AAV9-NanoCas, а биопсию скелетных мышц брали на четвертой и восьмой неделях, а дополнительные ткани анализировали на 12 неделе после лечения. Эффективность редактирования NanoCas в линиях клеток человека в среднем составила 20%, при этом 60% протестированных направляющих РНК достигли обнаруживаемой активности. Вариант D220R увеличил эффективность редактирования в различных тканях. In vivo редактирование Pcsk9 с помощью NanoCas у мышей привело к 60% частоте инделей, что соответствует SaCas9, при этом извлекая выгоду из меньшей нагрузки гена.
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — это изнурительное заболевание мышечной слабости, вызванное генетическими мутациями , и представляющее собой ценную цель для потенциальной терапии редактирования генов. Эксперименты по нацеливанию на МДД на гуманизированной мышиной модели продемонстрировали 10–40% редактирования в тканях четырехглавой мышцы, голени и сердца. У нечеловеческих приматов NanoCas достигал до 30% редактирования в скелетных мышцах, причем прогрессивные уровни редактирования увеличивались с течением времени. Редактирование сердца достигло 15%, а нецелевое редактирование в печени оставалось ниже 2%.
NanoCas представляет собой первую систему CRISPR с одним AAV, которая демонстрирует эффективное редактирование мышц in vivo у нечеловеческих приматов. Последствия такой компактной нуклеазы широкомасштабны, позволяя более широкое таргетирование тканей, более эффективную генную терапию и приложения для точного редактирования, включая приложения для редактирования оснований и эпигенетических модификаций.
Дополнительная информация: Бенджамин Дж. Раух и др., Редактирование скелетных мышц нечеловекообразных приматов с помощью CRISPR с использованием одного AAV с помощью NanoCas, ультракомпактной нуклеазы, bioRxiv (2025). DOI: 10.1101/2025.01.29.635576
Информация о журнале: bioRxiv